Patološka proteinurija je jedan od najvažnijih i trajnih znakova bolesti bubrega i mokraćnog sustava. Određivanje koncentracije proteina u mokraći bitan je i važan element testiranja urina. Identifikacija i kvantitativna procjena proteinurije važna je ne samo u dijagnostici mnogih primarnih i sekundarnih bolesti bubrega, nego i procjena promjena u intenzitetu proteinurije u dinamici nosi podatke o tijeku patološkog procesa, o učinkovitosti liječenja. Detekcija proteina u mokraći, čak iu tragovima, trebala bi biti alarmantna za moguće bolesti bubrega ili urinarnog trakta i zahtijeva ponovnu analizu. Posebno treba naglasiti besmislenost istraživanja mokraće, a osobito određivanje proteina urina bez poštivanja svih pravila za njegovo prikupljanje.

Sve metode za određivanje proteina u urinu mogu se podijeliti na:

• kvaliteta,
• semikvantitativna,
• Kvantitativna.

Kvalitativne metode

Svi visokokvalitetni uzorci proteina iz urina temelje se na sposobnosti denaturacije proteina pod utjecajem različitih fizikalnih i kemijskih čimbenika. U prisutnosti proteina u uzorku mokraće dolazi do zamućenja ili gubitka flokulentnog sedimenta.

Uvjeti za određivanje proteina u urinu na temelju reakcije zgrušavanja:

1. Urin bi trebao biti kiselinski. Alkalni urin je zakiseljen s nekoliko (2-3) kapi octene kiseline (5-10%).
2. Urin bi trebao biti čist. Zamućenje se eliminira kroz papirni filter. Ako zamućenje ne nestane, dodajte talk ili spaljeni magnezij (oko 1 čajna žličica na 100 ml urina), protresite i filtrirajte.
3. Kvalitativni test treba provoditi u dvije cijevi, od kojih jedna - kontrola.
4. Traženje zamućenosti treba biti na crnoj pozadini u propuštenom svjetlu.

Kvalitativne metode za određivanje proteina u urinu uključuju:

Kao što pokazuju brojne studije, nijedan od velikog broja poznatih metoda za kvalitativno određivanje proteina u urinu ne omogućava dobivanje pouzdanih i reproducibilnih rezultata. Unatoč tome, u većini CDL-a u Rusiji, ove metode su naširoko korištene kao skrining - u mokraći s pozitivnom kvalitativnom reakcijom, dalje se provodi kvantifikacija proteina. Od kvalitativnih reakcija češće se koristi Geller-ov test i uzorak sa sulfosalicilnom kiselinom, međutim, uzorak sa sulfosalicilnom kiselinom se smatra najprikladnijim za otkrivanje patološke proteinurije. Test vrenja trenutno se praktički ne koristi zbog njegove napornosti i trajanja.

Polukvantitativne metode

Brandberg-Roberts-Stolnikov metoda temelji se na Geller-ovom testu, tako da se ista pogreška primjećuje s ovom metodom kao i kod Geller-ovog testa.

Trenutno se dijagnostičke trake sve više koriste za određivanje proteina urina. Za polu-kvantitativno određivanje proteina u urinu na trakama, najčešće korištena boja je bromofenol plava u citratnom puferu. Sadržaj proteina u mokraći procjenjuje se prema intenzitetu plavo-zelene boje koja se razvija nakon kontakta reakcijske zone s urinom. Rezultat se ocjenjuje vizualno ili pomoću analizatora urina. Unatoč velikoj popularnosti i očiglednim prednostima suhe kemijske metode (jednostavnost, brzina analize), ove metode analize mokraće općenito i određivanje proteina osobito nisu bez ozbiljnih nedostataka. Jedna od njih, koja dovodi do izobličenja dijagnostičkih informacija, je veća osjetljivost indikatora bromofenol plavog na albumin u usporedbi s drugim proteinima. U tom smislu, test trake su uglavnom prilagođene detekciji selektivne glomerularne proteinurije, kada je gotovo sav protein urina predstavljen albuminom. Progresijom promjena i prelaskom selektivne glomerularne proteinurije u neselektivne (pojavu globulina u mokraći), rezultati određivanja proteina su podcijenjeni u odnosu na prave vrijednosti. Ova činjenica onemogućuje korištenje ove metode za određivanje proteina u mokraći za procjenu stanja bubrega (glomerularnog filtra) tijekom vremena. U tubularnoj proteinuriji također se podcjenjuju rezultati određivanja proteina. Određivanje proteina pomoću dijagnostičkih traka nije pouzdan pokazatelj niske razine proteinurije (većina trenutno dostupnih dijagnostičkih traka nema sposobnost hvatanja proteina u urinu u koncentraciji nižoj od 0,15 g / l). Negativni rezultati određivanja proteina na prugama ne isključuju prisutnost globulina, hemoglobina, uromucoida, Bens-Jones proteina i drugih paraproteina u urinu.

Pahuljice sluzi s visokim sadržajem glikoproteina (na primjer, kod upalnih procesa u mokraćnom sustavu, pyuria, bakteriurija) mogu se smiriti na indikatorskoj zoni trake i dovesti do lažno pozitivnih rezultata. Lažno pozitivni rezultati mogu biti povezani s visokom koncentracijom uree. Loša rasvjeta i loša percepcija boja mogu uzrokovati netočne rezultate.

U tom smislu, uporaba dijagnostičkih traka trebala bi biti ograničena na postupke provjere, a rezultati dobiveni uz njihovu pomoć trebali bi se smatrati samo indikativnim.

Kvantitativne metode

Ispravno kvantitativno određivanje proteina u mokraći u nekim slučajevima nije lak zadatak. Poteškoće pri njegovom rješavanju određuju sljedeći broj čimbenika:

• nizak sadržaj proteina u mokraći zdrave osobe, često na pragu osjetljivosti većine poznatih metoda;
• prisutnost u mokraći mnogih spojeva koji mogu ometati tijek kemijskih reakcija;
• značajne fluktuacije u sadržaju i sastavu proteina urina kod različitih bolesti koje otežavaju odabir odgovarajućeg kalibracijskog materijala.

U kliničkim laboratorijima se uglavnom koriste tzv. Rutinske metode za određivanje proteina u urinu, ali one ne daju uvijek zadovoljavajuće rezultate.

Sa stajališta stručnjaka analitičara koji radi u laboratoriju, metoda namijenjena kvantitativnom određivanju proteina urina mora udovoljavati sljedećim zahtjevima:

• imaju linearnu vezu između apsorpcije kompleksa nastalog tijekom kemijske reakcije i sadržaja proteina u uzorku u širokom rasponu koncentracija, čime se izbjegavaju dodatne operacije u pripremi uzorka za ispitivanje;
• trebaju biti jednostavni, ne zahtijevaju visokokvalificirane izvođače, izvode se s malim brojem operacija;
• imaju visoku osjetljivost, analitičku pouzdanost kada se koriste male količine ispitivanog materijala;
• biti otporni na različite čimbenike (varijacije u sastavu uzorka, prisutnost lijekova itd.);
• prihvatljivu cijenu;
• lako se mogu prilagoditi automatskim analizatorima;
• rezultat određivanja ne bi trebao ovisiti o sastavu proteina uzorka urina.

Nijedna od trenutno poznatih metoda za kvantitativno određivanje proteina u urinu ne može u potpunosti tvrditi da je "zlatni standard".

Kvantitativne metode za određivanje proteina u urinu mogu se podijeliti na turbidimetrijske i kolorimetrijske.

Turbidimetrijske metode

Turbidimetrijske metode uključuju:

• određivanje proteina sa sulfosalicilnom kiselinom (SSC),
• određivanje proteina s trikloroctenom kiselinom (THC),
• određivanje proteina benzetonijkloridom.

Turbidimetrijske metode temelje se na smanjenju topljivosti proteina urina zbog stvaranja suspenzije suspendiranih čestica pod utjecajem sredstava za taloženje. Sadržaj proteina u ispitnom uzorku procjenjuje se ili intenzitetom raspršenja svjetlosti, određenim brojem čestica raspršivanja svjetlosti (nefelometrijska metoda analize) ili slabljenjem svjetlosnog toka dobivenom suspenzijom (turbidimetrijska metoda analize).

Veličina rasipanja svjetlosti u metodama taloženja proteina u mokraći ovisi o mnogim čimbenicima: brzini miješanja reagensa, temperaturi reakcijske smjese, pH mediju, prisutnosti stranih spojeva, metodama fotometrije. Pažljivo pridržavanje reakcijskih uvjeta doprinosi stvaranju stabilne suspenzije s konstantnom veličinom čestica i dobivanjem relativno reproducibilnih rezultata.

Neki lijekovi utječu na rezultate turbidimetrijskih metoda za određivanje proteina u mokraći, što dovodi do takozvanih "lažno pozitivnih" ili "lažno negativnih" rezultata. To uključuje neke antibiotike (benzilpenicilin, kloksacilin, itd.), Radioaktivne tvari koje sadrže jod, sulfa lijekove.

Turbidimetrijske metode su slabo standardizirane, što često dovodi do pogrešnih rezultata, ali unatoč tome, oni se danas široko koriste u laboratorijima zbog niske cijene i dostupnosti reagensa. Najčešće korištena metoda u Rusiji je određivanje proteina sa sulfosalicilnom kiselinom.

Kolorimetrijske metode

Najosjetljivije i najtočnije su kolorimetrijske metode za određivanje ukupnog proteina urina na temelju specifičnih reakcija proteina u boji.

To uključuje:

1. biuretna reakcija,
2. Lowry metoda
3. metode temeljene na sposobnosti različitih boja za stvaranje kompleksa s proteinima:
   • Ponceau S (Ponceau S),
   • Coomassie Brilliant Blue Coomassie Briljantno plavo
   • Pirogalol crven.

S gledišta izvođača, u svakodnevnom radu laboratorija s velikim protokom istraživanja, biuretna metoda je nezgodna zbog velikog broja operacija. Istodobno, metodu karakterizira visoka analitička pouzdanost, omogućuje određivanje proteina u širokom rasponu koncentracija i detektiranje albumina, globulina i paraproteina usporedive osjetljivosti, zbog čega se biuretna metoda smatra referentnom i preporučuje se za usporedbu drugih analitičkih metoda za detekciju proteina u urinu. Biuretski postupak određivanja proteina u urinu poželjno se provodi u laboratorijima koji služe nefrološkim odjelima i koriste se u slučajevima gdje su rezultati određivanja drugim metodama upitni, kao i za određivanje količine dnevnog gubitka proteina u nefroloških bolesnika.

Lowryjeva metoda, koja ima veću osjetljivost od biuretske metode, kombinira biuretnu reakciju i Folinovu reakciju na aminokiseline tirozin i triptofan u proteinskoj molekuli. Unatoč visokoj osjetljivosti, ova metoda ne daje uvijek pouzdane rezultate pri određivanju sadržaja proteina u urinu. Razlog tome je nespecifična interakcija Folinovog reagensa s ne-proteinskim komponentama urina (najčešće aminokiseline, mokraćna kiselina, ugljikohidrati). Odvajanje ovih i drugih komponenti urina dijalizom ili precipitacijom proteina omogućuje uspješnu primjenu ove metode za kvantitativno određivanje proteina urina. Neki lijekovi - salicilati, klorpromazin, tetraciklini mogu utjecati na ovu metodu i iskriviti rezultate istraživanja.

Dovoljna osjetljivost, dobra reproducibilnost i lakoća određivanja proteina vezujućim bojama čine ove metode obećavajućim, ali visoka cijena reagensa sprečava njihovu širu uporabu u laboratorijima. Trenutno, metoda pirogalol crvene postaje sve češća u Rusiji.

Prilikom proučavanja razine proteinurije treba imati na umu da različite metode određivanja proteinurije imaju različitu osjetljivost i specifičnost prema brojnim proteinima urina.

Na temelju empirijskih podataka, preporuča se određivanje proteina dvjema različitim metodama i izračunavanje stvarne vrijednosti pomoću jedne od sljedećih formula:

proteinurija = 0,4799 B + 0,5230 L;
proteinurija = 1,5484 B - 0,4825 S;
proteinurija = 0,2167 S + 0,7579 L;
proteinurija = 1,0748 P - 0,0986 B;
proteinurija = 1.0104 P - 0.0289 S;
proteinurija = 0.8959 P + 0.0845 L;

gdje je:
B - rezultat mjerenja s Coomassie G-250;
L je rezultat mjerenja s Lowryjevim reagensom;
P - rezultat mjerenja s pirogalolnim molibdatom;
S je rezultat mjerenja sa sulfosalicilnom kiselinom.

S obzirom na izražene fluktuacije u razini proteinurije u različito doba dana, kao i ovisnost koncentracije proteina u urinu o diurezi, njezinu različitom sadržaju u pojedinim dijelovima urina, uobičajeno je za patologiju bubrega procijeniti težinu proteinurije dnevnim gubitkom proteina u urinu, odnosno odrediti tzv. dnevna proteinurija. Izražava se u g / danu.

Ako je nemoguće prikupiti dnevni urin, preporuča se odrediti koncentraciju proteina i kreatinina u jednoj porciji mokraće. Budući da je brzina oslobađanja kreatinina tijekom dana prilično konstantna i ne ovisi o promjenama u brzini mokrenja, omjer koncentracije proteina i koncentracije kreatinina je konstantan. Ovaj omjer dobro korelira s dnevnim izlučivanjem proteina i stoga se može koristiti za procjenu ozbiljnosti proteinurije. Normalni omjer proteina / kreatinina trebao bi biti manji od 0,2. Protein i kreatinin mjere se u g / l. Važna prednost metode procjene težine proteinurije omjerom proteina-kreatinina je potpuno uklanjanje pogrešaka povezanih s nemogućnošću ili nepotpunim prikupljanjem dnevnog urina.

reference:

• O. V. Novoselova, M. B. Pyatigorskaya, Yu. E. Mihajlov, "Klinički aspekti otkrivanja i procjene proteinurije", Priručnik voditelja CPL-a, br. 1, siječanj 2007.
• A. V. Kozlov, "Proteinurija: metode za njezino otkrivanje", predavanje, St. Petersburg, SPbMAPO, 2000
• VL Emanuel, “Laboratorijska dijagnostika bolesti bubrega. Mokraćnog sindroma ”, - Priručnik glave KDL-a, br. 12, prosinac 2006
• VI Pupkova, L.M. Prasolov - Određivanje proteina u urinu i cerebrospinalnoj tekućini. Koltsovo, 2007
• Priručnik za metode kliničkih laboratorijskih istraživanja. Ed. E. A. Kost. Moskva, "Medicina", 1975

Srodni članci

Kvantitativne metode za određivanje ukupnog proteina urina

Svaki uzorak urina prikladan je za kvantifikaciju proteina. Većina istraživača preferira određivanje količine proteina u urinu prikupljenog dnevno kako bi se utvrdio dnevni gubitak proteina.

Odjeljak: Analiza urina

Polukvantitativne metode za određivanje ukupnog proteina u urinu

Trenutno se dijagnostičke trake sve više koriste za određivanje proteina urina. Za polu-kvantitativno određivanje proteina u urinu na trakama, najčešće korištena boja je bromofenol plava u citratnom puferu. Sadržaj proteina u mokraći procjenjuje se prema intenzitetu plavo-zelene boje koja se razvija nakon kontakta reakcijske zone s urinom.

Odjeljak: Analiza urina

Kvalitativne metode za određivanje ukupnog proteina u urinu

Svi visokokvalitetni uzorci proteina iz urina temelje se na sposobnosti denaturacije proteina pod utjecajem različitih fizikalnih i kemijskih čimbenika. U prisutnosti proteina u uzorku mokraće dolazi do zamućenja ili gubitka flokulentnog sedimenta.

Odjeljak: Analiza urina

Određivanje proteina urina u uzorku s 20% sulfosalicilne kiseline

Uzorak s 20% sulfosalicilnom kiselinom odnosi se na kvalitativne reakcije za određivanje proteina u urinu. Budući da se temelji na reakciji koagulacije, test urina mora zadovoljiti određene zahtjeve: biti proziran i imati kiselinsku reakciju.

Odjeljak: Analiza urina

Testiranje prstena Gellera

Geller test je kvalitativna reakcija za određivanje proteina urina. Budući da se temelji na reakciji koagulacije, test urina mora zadovoljiti određene zahtjeve: biti proziran i imati kiselinsku reakciju.

Odjeljak: Analiza urina

Metode za određivanje proteina u urinu

Mala količina bjelančevina u dnevnoj mokraći također se nalazi u potpuno zdravih osoba, međutim, takve male koncentracije se ne otkrivaju u pojedinačnim obrocima koristeći trenutno korištene metode. Približno 70% proteina urina zdrave osobe predstavlja uromucoid, protein koji je proizvod tkiva bubrega; dakle, udio glomerularnog proteina u mokraći zdravih ljudi je zanemariv, a proteinurija je normalno 50-150 mg / dan, pri čemu je većina proteina urina identična sirutki.

Prihvaćeno je razlikovati sljedeće oblike proteinurije ovisno o mjestu nastanka: prerenalna, povezana s povećanim raspadom proteina u tkivu, teškom hemolizom; bubrega, zbog patologije bubrega, koja se može podijeliti na glomerularnu i tubularnu; postrenalna, povezana s patologijom mokraćnog sustava i najčešće uzrokovana upalnom eksudacijom.

Ovisno o trajanju postojanja, ispuštaju trajnu proteinuriju, koja postoji već nekoliko tjedana, pa čak i godina, i prolazna, koja se povremeno pojavljuje, ponekad čak iu odsutnosti bolesti bubrega, primjerice, kod groznice i teške intoksikacije. Preporučljivo je razlikovati varijabilnost proteinurije: dnevni gubitak proteina do 1 g - umjeren, od 1 do 3 g - srednji i više od 3 g - izražen.

Otkrivanje u mokraći proteina s relativno velikom molekularnom težinom ukazuje na odsutnost selektivnosti renalnog filtra i njegovu izraženu štetu. U tim slučajevima govorimo o niskoj selektivnosti proteinurije. Stoga je u ovom trenutku definicija frakcija proteina urina postala široko rasprostranjena. Najtočnije metode su elektroforeza u škrobnim i poliakrilamidnim gelovima.
Prema rezultatima dobivenim ovim metodama, može se procijeniti selektivnost proteinurije.

Većina kvalitativnih i kvantitativnih metoda za određivanje proteina u mokraći temelji se na njegovoj koagulaciji u volumenu mokraće ili na granici medija (urin i kiselina); ako postoji način za mjerenje intenziteta koagulacije, tada uzorak postaje kvantitativan.

Ujedinjena analiza sulfosalicilne kiseline:

Potrebni reagens:

20% otopina sulfosalicilne kiseline.

Tijek studija:

U 2 epruvete ulijte 3 ml filtriranog urina. U epruvetu dodajte 6-8 kapi reagensa. Na tamnoj pozadini usporedite kontrolnu cijev s iskusnim. Zamućenost epruvete ukazuje na prisutnost proteina, a uzorak se smatra pozitivnim.

Ako je reakcija urina alkalna, tada se prije pregleda zakiseli s 2-3 kapi 10% vodene otopine octene kiseline.

Unified Method: Brandberg-Roberts-Stolnikov:

Metoda se temelji na uzorku prstena Gellera, koji se sastoji od činjenice da se na granici dušične kiseline i urina, u prisutnosti proteina, javlja njegova zgrušavanja i pojavljuje se bijeli prsten.

Potrebni reagens:

30% otopina dušične kiseline (relativne gustoće 1,2) ili reagensa Larionic.
Priprema reagensa Larion: 20-30 g natrijevog klorida se otopi zagrijavanjem u 100 ml destilirane vode, ostavi se da se ohladi, filtrira. U 99 ml filtrata ulije se 1 ml koncentrirane dušične kiseline.

Tijek studija:

U cijev se ulije 1-2 ml dušične kiseline (ili reagensa za lionsku kiselinu) i pažljivo, preko zida cijevi, nanosi se ista količina filtriranog urina. Pojava tankog bijelog prstena na granici između dvije tekućine između 2. i 3. minute ukazuje na prisutnost proteina u koncentraciji od približno 0,033 g / l. Ako se prsten pojavi prije 2 minute nakon nanošenja slojeva, urin treba razrijediti vodom i ponovno nanositi već razrijeđeni urin. Stupanj razrjeđenja urina odabire se ovisno o tipu prstena, tj. njegova širina, zbijenost i vrijeme izgleda. S prstenastim prstenom, koji se pojavio prije 2 minute, mokraća se razrjeđuje 2 puta, široka - 4 puta, s kompaktnim - 8 puta, itd. Koncentracija proteina izračunava se množenjem 0,033 sa stupnjem razrjeđenja i izražava se u gramima na 1 l (g / l).

Ponekad se dobije bijeli prsten kada su prisutne velike količine urata. Za razliku od proteinskog prstena, urat je nešto viši od granice između dvije tekućine i otapa se kada se malo zagrije.

Kvantitativno određivanje bjelančevina u mokraći zbog zamućenja, nastalog dodavanjem sulfosalicilne kiseline:

Načelo metode:

Intenzitet zamućenja tijekom koagulacije proteina sa sulfosalicilnom kiselinom proporcionalan je njegovoj koncentraciji.

Potrebni reagensi:

1. 3% otopina sulfosalicilne kiseline.

2. 0,9% otopina natrijevog klorida.

3. Standardna otopina albumina - 1% otopina (1 ml otopine koja sadrži 10 mg albumina): 1 g liofiliziranog albumina (iz humanog ili goveđeg seruma) otopi se u maloj količini 0,9% otopine natrijevog klorida u tikvici kapaciteta 100 ml, a zatim istom otopinom podesi na oznaku. Reagens se stabilizira dodavanjem 1 ml 5% otopine natrijevog azida (NaN3). Kada se čuva u hladnjaku, reagens vrijedi 2 mjeseca.

Posebna oprema - fotoelektrični kolorimetar.

Tijek studija:

U epruvetu se stavi 1,25 ml filtriranog urina, dopuni se do 5 ml s 3% otopinom sulfosalicilne kiseline i pomiješa. Nakon 5 minuta, mjere se na fotoelektričnom kolorimetru na valnoj duljini od 590–650 nm (narančasti ili crveni svjetlosni filtar) uz kontrolu u ćeliji s duljinom optičkog puta od 5 mm. Kontrola je epruveta u kojoj je na 1,25 ml filtriranog urina dodano do 5 ml 0,9% otopine natrijevog klorida. Izračun se provodi prema kalibrirajućem rasporedu, za konstrukciju čija se razrjeđenja pripremaju iz standardne otopine, kako je navedeno u tablici.

Iz svake dobivene otopine uzima se 1,25 ml i tretira se kao eksperimentalni uzorak.

Pravocrtna ovisnost pri izradi kalibracijskog grafa pohranjuje se do 1 g / l. Pri višim koncentracijama uzorak se treba razrijediti i uzeti u obzir razrjeđenje u izračunu.

Lažno pozitivni rezultati mogu se dobiti ako postoje kontrastna sredstva u urinu koji sadrže organski jod. Stoga se test ne može koristiti kod osoba koje uzimaju jodne pripravke; lažno pozitivan rezultat može biti i zbog pripravaka sulfanilamida, velikih doza penicilina i visokih koncentracija mokraćne kiseline u mokraći.

Biuretska metoda:

Načelo metode:

Peptidne veze proteina s bakrenim solima u alkalnoj C tvore kompleks ljubičaste boje. Proteini se prethodno talože s trikloroctenom kiselinom.

Potrebni reagensi:

1. 10% otopina trikloroctene kiseline.
2. 20% otopina bakra (CuSO4 H 5H2O).
3. 3% otopina NaOH.

Tijek studija:

U 5 ml urina uzete iz dnevne količine, dodati 3 ml otopine trikloroctene kiseline, centrifugirati do konstantnog volumena sedimenta. Supernatant se odsiše pipetom, talog se zatim otopi u 5 ml otopine NaOH. U otopinu se doda 0,25 ml CuS04, smjesu se miješa i centrifugira. Supernatant se fotometrira na valnoj duljini od 540 nm u kiveti s optičkom stazom dužine 10 mm prema destiliranoj vodi. Koncentracija proteina izračunava se iz kalibracijske krivulje, dok se crtežom ucrtava koncentracija proteina (g / l) na y-osi i optička gustoća u jedinicama za ekstinkciju na osi apscise. Na temelju dobivene koncentracije izračunava se dnevni gubitak proteina u urinu.

Korištenje indikatorskog papira (traka):

Protein se može detektirati pomoću indikatorskog papira (trake) koje proizvode "Albuphan", "Ames" (Engleska), "Albustix", "Boehringer" (Njemačka), "Comburtest", itd.

Princip se temelji na fenomenu takozvane proteinske pogreške nekih kiselinsko-baznih pokazatelja. Pokazateljski dio papira je zasićen tetrabromofenol plavom i citratnim puferom. Kada se papir navlaži, pufer se otapa i osigurava odgovarajući pH za reakciju indikatora.

Na 3,0-3,5 amino skupine proteini reagiraju s indikatorom i mijenjaju svoju izvornu žutu boju u zelenkasto plavu, nakon čega se, u usporedbi sa skalom boja, može grubo procijeniti koncentracija proteina u urinu. Glavni preduvjet za pravilan rad indikatorskih traka je da se postigne pH u rasponu od 3,0-3,5 da bi reakcija nastala.

Ako je papir u dodiru s urinom koji se ispituje duže od izloženosti navedenom u uputama, citratni pufer se otapa u njemu, a indikator reagira na pravi pH urina, tj. daje lažno pozitivnu reakciju. S obzirom na činjenicu da je kapacitet pufera ograničen, čak i ako se smjernice slijede u uzorcima previše alkalne urina (pH> 6,5), dobiveni su lažno pozitivni rezultati, a u uzorcima previše kiselog urina (pH 6,5) mokraća, s niskom relativnom gustoćom. mokraće i niske koncentracije bens jones proteina.

Potrebni reagensi:

2 M acetatni pufer pH 4.9.

Tijek studija:

Filtrirani urin u količini od 4 ml pomiješa se s 1 ml pufera i grije se 15 minuta u vodenoj kupelji na temperaturi od 56 ° C. U prisutnosti Bens-Jones proteina, unutar 2 minute javlja se izraženi precipitat, a ako je koncentracija Bens-Jones proteina manja od 3 g / l, uzorak može biti negativan. U praksi je to iznimno rijetko, jer je najvećim dijelom koncentracija Bens-Jones proteina u mokraći značajna.

S potpunom sigurnošću, Bens-Jonesov protein može se detektirati imunoelektroforetskom studijom pomoću specifičnih seruma protiv teških i lakih lanaca imunoglobulina.

Određivanje albumoze (proteoze):

Albumozi su produkti cijepanja proteina, čije se načelo temelji na činjenici da se ne kuhaju, nego daju pozitivnu biuretnu reakciju i sole se s nekim solima, posebno amonijevim sulfatom i cinkovim acetatom u kiselom mediju.

Normalni urin ne sadrži albumozu. Tragovi mogu biti u normalnom urinu u slučaju nečistoće sjemena. U patologiji se može javiti albumoza u mokraći tijekom febrilnih stanja, transfuzija krvi i plazme, resorpcija eksudata i transudata, te dezintegracija tumora.

Potrebni reagensi:

1. Zasićena otopina natrijevog klorida.
2. Koncentrirana otopina kaustične sode.
3. Slaba otopina bakrenog sulfata (gotovo bezbojna).

Tijek studija:

U urin se doda zasićena otopina natrijevog klorida (1/3 volumena), zakiseljena octenom kiselinom, prokuha i vruća tekućina se filtrira. Albumozi prolaze u filtrat u kojem se njihova prisutnost određuje biuretnom reakcijom. Filtratu dodati 1/2 volumena koncentrirane otopine kaustične sode i nekoliko kapi slabe otopine bakrenog sulfata. Kod pozitivnog uzorka dobiva se crveno-ljubičasta boja.

Pozitivnim testom sa sulfosalicilnom kiselinom urin se zagrijava. Ako zamućenost nestane i ponovno se pojavi kada se ohladi, to znači da urin sadrži albumuse ili proteinsko tijelo Bens-Jonesa.

Proteini u mokraći, laboratorijski testovi

Metode određivanja proteina urina

Za kliniku je važno kvalitativno i kvantitativno određivanje proteina u urinu.

Kvalitativni testovi za određivanje proteina urina
Predloženo je više od 100 reakcija za kvalitativno određivanje proteina u urinu. Većina se temelji na oborinama proteina fizičkim (grijanjem) ili kemijskim sredstvima. Prisustvo proteina dokazano je pojavom zamućenosti.

Također su zanimljivi kolorimetrijski suhi uzorci.

U nastavku će biti opisana samo najvažnija za praksu uzorka.

Ispitivanje sulfosalicilne kiseline. U nekoliko mililitara urina dodajte 2-4 kapi 20% otopine sulfosalicilne kiseline. Kada se pojavi pozitivna reakcija, dolazi do zamućenja. Rezultat je označen izrazima: opalescencija, slabo pozitivna, pozitivna ili jako pozitivna reakcija. Test sulfosalicilne kiseline jedan je od najosjetljivijih uzoraka za uspostavljanje proteina u urinu. Ona pronalazi i najmanji abnormalni porast proteina urina. Zahvaljujući jednostavnoj tehnici, ovaj test je našao široku primjenu.

Test s aseptolom. Aseptol je zamjena za sulfosalicilnu kiselinu. Može se pripremiti iz materijala dostupnih u bilo kojem laboratoriju (fenol i sumporna kiselina). Kao reagens koristi se 20% -tna otopina aseptola. Test se provodi na sljedeći način: u epruvetu koja sadrži 2-3 ml urina, dodati 0,5-1-1 ml otopine aseptola na dno. Ako bijeli prsten koaguliranog proteina ispadne na granici između dvije tekućine, uzorak je pozitivan.

Gellerov test. Pod nekoliko mililitara urina soliti se 1-2 ml 30% dušične kiseline (težina specifične težine 1,20). Ako se na granici obje tekućine proizvede bijeli prsten, uzorak je pozitivan. Reakcija postaje pozitivna ako je protein veći od 3,3 mg%. Ponekad se dobije bijeli prsten kada su prisutne velike količine urata. Za razliku od proteinskog prstena, uratni prsten se ne pojavljuje na granici između dviju tekućina, već nešto veći. Larionova predlaže korištenje umjesto 30% dušične kiseline kao reagensa 1% otopina dušične kiseline u zasićenoj otopini natrijevog klorida; To osigurava velike uštede u dušičnoj kiselini.

Uzorak s zlezystosinerodisty kalija i octene kiseline. Ova reakcija omogućuje izolaciju serumskih proteina iz nukleoalbumina.

Jednake količine mokraće ulivaju se u dvije epruvete. U jednom od njih dodajte nekoliko kapi 30% otopine octene kiseline. Ako se dobije mutnoća u usporedbi s kontrolnom epruvetom, urin sadrži nukleoalbumin. Ako se ne pojavi zamućenost, sadržaj obje epruvete se miješa i ponovno se dijeli na dva dijela. U jednu od dvije epruvete dodajte nekoliko kapi (višak može pretvoriti pozitivni uzorak u negativan) 10% otopine soli žute krvi (kalijev ferocijanidni sirup). U prisutnosti proteina sirutke dobivena je zamućenost.

Kod koncentriranog urina koji sadrži velike količine mokraćne kiseline i urata, uzorak s kalijem i sirupom gvožđa i octene kiseline treba provesti nakon prethodnog razrjeđivanja (2-3 puta) vode s urinom. Inače može doći do zamućenja uzrokovanog istaloženom mokraćnom kiselinom.

To je osobito važno u proučavanju mokraće u dojenčadi, koja sadrži mnogo mokraćne kiseline i urata.

Od ostalih kvalitativnih uzoraka proteina u mokraći, temeljenih na taloženju proteina, primjenjuju se testovi vrenja, Esbach, Perdi, Roberts, Almen, Balloni, Buro, Claudius, Corso, Kupola, Goodmann-Suzanne, Jolla, Exton, Kamlet, Kobuladze, Liliendal-Petersen, Polacci, Pons, Spiegler, Tanre, Thiele, Brown, Tsushia, itd.

U proizvodnji visokokvalitetnih uzoraka proteina u mokraći, temeljenih na taloženju proteina, potrebno je poštivati ​​sljedeća opća pravila, kršenje kojih dovodi do značajnih pogrešaka u istraživanju.

1. Mokraća koja se testira mora biti kisela. Uz alkalnu reakciju urin se blago zakiseli s octenom kiselinom. Proizvodnja uzorka s alkalnom urinom, u slučajevima kada se kiselina koristi kao reagens, može dovesti do neutralizacije kiseline i do negativnog rezultata s pozitivnom reakcijom. To posebno vrijedi za ispitivanje sulfosalicilne kiseline, jer se kiselina dodaje u vrlo malim količinama i lako se može neutralizirati.

2. Istraženi urin treba biti proziran.

3. Uzorci za određivanje proteina u mokraći uvijek se moraju izvesti u dvije epruvete, od kojih jedna služi kao kontrola. Bez kontrolne cijevi, može se primijetiti da tijekom reakcije ne dolazi do svjetlosne mutnoće.

4. Količina dodane kiseline u uzorcima ne smije biti prevelika. Velika količina kiseline može dovesti do stvaranja topljivog acidolbumina i transformacije pozitivnog uzorka u negativan.

Zbog svoje jednostavne tehnike kolorimetrijski suhi uzorci zaslužuju veliku pozornost. Kada se koriste ti uzorci, učinak koji protein ima na boju indikatora u puferskoj otopini (takozvani indikatori proteinske pogreške). Filtarski papir s puferom limunske kiseline i bromofenol plavim kao indikatorom se apsorbira u urin kratko vrijeme. Uzorak je pozitivan ako postane plavo-zelene boje. Uspoređujući intenzitet boje s normama papira u boji, moguće je izvesti približno i kvantitativne zaključke. Papir za pokazivanje prodaje se u pakiranjima s odgovarajućim standardima boje, poput univerzalnog indikatorskog papira.

Metode za kvantitativno određivanje proteina urina
Predložene su mnoge metode za kvantitativno određivanje proteina urina. Točne kvantitativne metode za određivanje proteina u biološkom materijalu nisu široko korištene u određivanju proteina u mokraći, zbog složenih i dugotrajnih tehnika. Volumetrijske metode su raširene, osobito Esbachova metoda. Vrlo su jednostavni, ali nažalost nisu baš precizni. Metode Brandberg-Stolnikov grupe, koje daju točnije rezultate od volumetrijskih metoda, s relativno jednostavnom tehnikom, također su pogodne za kliniku. U prisustvu fotometra ili nefelometra, nefelometrijske metode su također prikladne.

Esbachova metoda. Predložio ga je pariški liječnik Esbach 1874. godine. Posebna cijev (Esbachov albuminometar) izlivena je urinom i reagensom. Cijev je zapečaćena gumenim čepom, temeljito promiješana (bez premlaćivanja!) I ostavljena u uspravnom položaju do sljedećeg dana. Izvijestite o podjeli, koja doseže kolonu precipitata proteina. Pronađeni broj pokazuje sadržaj proteina. Vrlo je važno kod Esbachove metode da je mokraća. Alkalni urin može neutralizirati kisele sastojke reagensa i spriječiti taloženje proteina.

Prednosti metode: jednostavna je i praktična u praksi.

Nedostaci: metoda je netočna, rezultat se dobiva nakon 24 - 48 sati.

Brandberg-Stolnikov metoda. Temelji se na Gellerovom testu kvalitete. Za kvantitativno određivanje može se upotrijebiti Gellerov uzorak jer daje pozitivan rezultat sa sadržajem proteina iznad 3,3 mg%. To je krajnja koncentracija proteina ispod koje uzorak postaje negativan.

Modifikacija Ehrlicha i Althausena. Sovjetski znanstvenici S. L. Ehrlich i A. Ya Altgauzen modificirali su Brandberg-Stolnikovovu metodu, ukazujući na mogućnosti pojednostavljenja istraživanja i uštede vremena u njegovoj proizvodnji.

Prvo pojednostavljenje povezano je s vremenom pojavljivanja prstena. Točno se određuje vrijeme njegovog nastupa, bez nužnog pridržavanja 2. i 3. minute.

Drugo pojednostavljenje omogućuje utvrđivanje vrste oplodnje. Autori su dokazali da se potrebno razrjeđenje može približno odrediti tipom dobivenog prstena. Razlikuju nitaste, široke
i kompaktni prsten.

Od nefelometrijskih metoda, Kingsberry i Clark metoda zaslužuje da bude zabilježena. 2,5 ml filtriranog urina izlije se u mali stupnjeviti cilindar, nadopunjuje se s 3% vodenom otopinom sulfosalicilne kiseline do 10 ml. Dobro promiješati i nakon 5 minuta fotometrirati u kiveti od 1 cm, sa žutim filtrom, koristeći vodu kao kompenzacijsku tekućinu. S fotometrom Pulfrich, pronađeno izumiranje, pomnoženo s 2,5, daje količinu proteina u% o. U slučaju kada je indeks ekstinkcije veći od 1,0, mokraća se prethodno razrijedi 2 puta, 4 puta ili čak i više.

Da bi se dobila jasna predodžba o količini izlučenih proteina u urinu, potrebno je odrediti ne samo njihovu koncentraciju u odvojenom dijelu mokraće, već i njihovu ukupnu dnevnu količinu. Da biste to učinili, skupite pacijentov urin tijekom 24 sata, izmjerite njegov volumen u mililitrima i odredite koncentraciju proteina u dijelu dnevnog urina u g%. Količina proteina koja se izlučuje u urinu u 24 sata određuje se ovisno o dnevnoj količini urina u gramima.

Klinički značaj proteina u urinu

Ljudski urin obično sadrži minimalne količine proteina koje se ne mogu ustanoviti uobičajenim kvalitativnim uzorcima za ispitivanje proteina urina. Izlučivanje velikih količina bjelančevina, u kojima obični visokokvalitetni uzorci proteina u mokraći postaju pozitivni - abnormalna pojava, nazvana proteinurija. Proteinurija je fiziološka samo kod novorođenčadi, u prvih 4-10 dana nakon rođenja. Naziv albuminurija, koji se uobičajeno koristi, pogrešan je, jer se ne samo albumin, već i druge vrste proteina (globulini, itd.) Izlučuju u urinu.

Proteinuriju, kao dijagnostički simptom, otkrio je 1770. Cotuno.

Najvažnija funkcionalna bubrežna proteinurija u djece je sljedeća:

1. Fiziološka proteinurija novorođenčeta. Pojavljuje se kod većine novorođenčadi i nema nikakav negativan značaj. To se objašnjava nezrelim bubrežnim filtrom, oštećenjem rođenja ili gubitkom tekućine u prvim danima života. Fiziološka proteinurija nestaje na 4-10 dan nakon rođenja (kasnije kod prerano rođene djece). Količina proteina je mala. To je nukleoalbumin.

Neonatalna albuminurija, koja traje dugo vremena, može biti simptom kongenitalne lues.

2. Albuminurija moždanog udara. One su uzrokovane prekoračenjem praga normalne razdražljivosti bubrežnog filtera značajnim mehaničkim, toplinskim, kemijskim, mentalnim i drugim iritacijama - gubitkom tekućine u dojenčadi (dehidracijska proteinurija), hladnim kupanjem, obilnom hranom bogatom proteinima (alimentarna proteinurija), palpacijom bubrega (palpatorna albuminurija), fizički preopterećen, strah, itd.

Albuminurija moždanog udara lakše se javlja u djece rane dobi nego kod djece u starijoj dobi i kod odraslih, budući da su bubrezi djeteta i malog djeteta lakše nadraženi. Dehidracijska albuminurija (poremećaj hranjenja, hidrolabilnost, toksikoza, proljev, povraćanje) osobito je česta u dojenčadi.

Albuminurija moždanog udara je benigna. Oni nestaju odmah nakon uklanjanja njihovih uzroka. Povremeni leukociti, cilindri i crvena krvna zrnca ponekad se nalaze u sedimentu. Protein je najčešće nukleoalbumin.

3. Ortostatska proteinurija. Ovo stanje je karakteristično za djecu predškolske i školske dobi. Pojavljuje se na temelju vazomotornih poremećaja u dovodu krvi u bubreg. Tipično za ortostatsku albuminuriju (otuda i njeno ime) je da se pojavljuje samo kada dijete stoji, kada je kralježnica u lordotičnom položaju. U ležećem položaju nestaje. Nukleoalbumin se oslobađa. U sumnjivim slučajevima možete pribjeći ortostatičnom iskustvu, koje se sastoji u sljedećem: u večernjim satima, sat vremena prije spuštanja, dijete prazni mjehur; ujutro, kad ustane iz kreveta, on ponovno oslobađa urin. Ovaj urin ne sadrži bjelančevine. Zatim se dijete stavi na koljena 15-30 minuta s štapom iza leđa, između savijenih laktova obje ruke. Stvara poziciju lordoze, koja dovodi do oslobađanja proteina, bez promjena u sedimentu.

Uz ortostatsku albuminuriju može se osloboditi 8-10 g proteina dnevno.

Organska bubrežna proteinurija je od najveće kliničke važnosti između svih proteinurija. One su uzrokovane organskim bolestima bubrega (nefritis, nefroza, nefroskleroza). Proteinurija je jedan od najvažnijih i najpoznatijih simptoma organske bolesti bubrega.

1. Kod akutnog i kroničnog glomerulonefritisa, redovito se javlja proteinurija. Količina proteina je umjerena i ne postoji usporedba između stupnja proteinurije i ozbiljnosti bolesti. Nasuprot tome, kronična i teža žad često se javljaju s manjim količinama proteina nego akutnim. Nakon akutnog nefritisa, ponekad dulje vrijeme (godine), ustanovljene su male količine proteina u mokraći, koje nemaju patološki značaj ("rezidualni albuminurija"). Ne treba zaboraviti da se može pojaviti i “nefritis bez proteinurije”. Ponekad se protein nalazi u jednom dijelu mokraće, au drugom nije. Omjer albumina i globulina kod akutnog nefritisa je nizak, a kod kroničnog nefritisa veći.

2. U slučaju nefroskleroze, količina bjelančevina u mokraći je beznačajna, često se javljaju oblici bolesti bez proteina u urinu.

3. Od svih bubrežnih bolesti, nefroza se javlja s najizraženijom proteinurijom.

4. U slučaju infektivnih i toksičnih stanja nađena su tzv. Febrilna i toksična proteinurija. To su akutna nefroza u kojoj je količina proteina mala. U ovu skupinu ubrajaju se i proteinurija u konvulzivnim stanjima (konvulzije), hipertireoza, žutica, invaginacija, enterokolitis, opekline, teška anemija itd. Ovi albuminuriji su benigni i brzo prolaze (prolazna albuminurija).

5. Kada se krv stagnira u bubrezima javlja se tzv. Kongestivna albuminurija koja je karakteristična za kardiovaskularne bolesnike u fazi dekompenzacije. Također se nalazi u ascitesu i tumorima trbuha.

U febrilnoj, toksičnoj i kongestivnoj albuminuriji povećana propusnost renalnog filtra je posebno izražena. Prema nekim autorima, mnogi od tih proteinurija javljaju se bez organskog oštećenja bubrežnog parenhima.

Extrarenalnu albuminuriju obično uzrokuju nečistoće proteina (izlučevine, razbijene stanice) koje izlučuju oboljeli mokraćni sustav i spolni organi. Često su pronašli i ekstrarealni albuminuriju zbog cistopielitisa (pyuria), rjeđe zbog vulvovaginitisa, kamenca i tumora mokraćnog sustava.

Kada extrarenal albuminurija u sedimentu pronaći veliki broj leukocita i bakterija. Bubrežni elementi gotovo nikad ne nastaju. Količina proteina je mala. Filtrirani ili centrifugirani urin obično ne daje pozitivan uzorak proteina.

Kod osoba koje se oporavljaju od pijelitisa, albuminurija nestaje nakon bakterija i purije.

Kao karakterističan fenomen treba naglasiti da su u ranom djetinjstvu organske bolesti bubrega iznimno rijetke, stoga je i rijetka organska proteinurija. Od njih se, uglavnom, nalaze febrilne i toksične. Za razliku od organske proteinurije, albuminurija moždanog udara vrlo je česta u male djece.

Kod starije djece, organska proteinurija je češće funkcionalna. Općenito, s godinama, funkcionalna proteinurija je rjeđa, a organska češća.

Elektroforetska ispitivanja proteina u urinu

Brojni autori koriste elektroforetsku metodu za proučavanje proteina u mokraći (uroproteini). Iz dobivenog elektroforegrama vidljivo je da imaju isti kvalitativni sastav kao i proteini plazme. To pokazuje da proteini u urinu potječu iz proteina plazme.

Kvalitativno i kvantitativno određivanje proteina u urinu.

Normalne vrijednosti: normalan protein u urinu sadržan je u minimalnim količinama koje se ne otkrivaju uobičajenim kvalitativnim reakcijama. Gornja granica norme proteina u urinu je 0,033 g / l. Ako je sadržaj proteina veći od te vrijednosti, tada visokokvalitetni proteinski uzorci postaju pozitivni.

Klinički značaj definicije:

Pojava proteina u urinu naziva se proteinurija. Proteinurija može biti lažna i bubrežna. Extrarenalna proteinurija može biti u prisutnosti nečistoća proteinskog podrijetla iz genitalnih organa (vaginitis, uretritis, itd.), Dok je količina proteina beznačajna - do 0.01 g / l. Bubrežna proteinurija može biti funkcionalna (s hipotermijom, fizičkim naporom, vrućicom) i organskim - s glomerulonefritisom, pijelonefritisom, nefritisom, nefrozom, zatajenjem bubrega. Kod bubrežne proteinurije sadržaj proteina može biti od 0,033 do 10-15 g / l, a ponekad i veći.

Načelo metode: temelji se na činjenici da se bjelančevine pod djelovanjem anorganskih kiselina koaguliraju (postaju vidljive). Stupanj zamućenosti ovisi o količini proteina.

Detekcija proteina u urinu s 20% sulfosalicilne kiseline.

Reagensi: 20% otopina sulfosalicilne kiseline. Oprema: tamna pozadina.

1. Zahtjevi za urinom: mokraća mora biti kisela (ili blago kisela) pH, mora biti prozirna, u tu svrhu se urin centrifugira. Alkalni urin je zakiseljen do slabo kiselog reakcijskog medija, upotrebom indikatorskog papira za kontrolu.

2. U 2 epruvete istog promjera ulijte 2 ml pripremljenog urina. 1 epruveta - kontrola, 2 - iskustvo. U epruvetu dodajte 4 kapi 20% sulfosalicilne kiseline.

3. Rezultat je označen na tamnoj pozadini.

4. U prisustvu proteina, urin u epruveti postaje mutan.

Visokokvalitetno određivanje proteina u urinu test trakama.

Za identificiranje proteinurije koriste se različite monotest trake: Albufan, Albustiks, Biofan E i politički testovi: Triscan, Nonafan i drugi.

Detekcija proteina u urinu metodom Robertsa - Stolnikov.

Načelo metode: temelji se na činjenici da se bjelančevine pod djelovanjem anorganskih kiselina koaguliraju (postaju vidljive). Stupanj zamućenosti ovisi o količini proteina (tj. Geller testu prstena). Kada je koncentracija proteina u urinu 0,033 g / l, do kraja 3 minute nakon nanošenja urina pojavljuje se tanak bijeli konac.

Reagensi: 50% otopina dušične kiseline ili Robertsovog reagensa (98 dijelova zasićene otopine natrijevog klorida i 2 dijela koncentrirane klorovodične kiseline) ili reagensa Larionske (98 dijelova zasićene otopine natrijevog klorida i 2 dijela koncentrirane dušične kiseline).

Oprema: tamna pozadina.

1. Zahtjevi za urinom: mokraća mora biti kisela (ili blago kisela) pH, mora biti prozirna, u tu svrhu se urin centrifugira. Alkalni urin je zakiseljen do slabo kiselog reakcijskog medija, upotrebom indikatorskog papira za kontrolu.

2. Ulijte 2 ml 50% -tne otopine dušične kiseline ili jedan od reagensa u epruvetu, a zatim oprezno ulijte istu količinu pripremljenog urina uz zid epruvete pipetom.

3. Uzorak se ostavi 3 minute

4. Nakon 3 minute prijavite rezultat. Rezultat je označen na tamnoj pozadini u emitiranom svjetlu. Ako je prsten širok, kompaktan, mokraća se razrijedi destiliranom vodom i ponovno nanese na reagens.

5. Mokraća se razrijedi dok se nakon 3 minute ne stvori tanki vlaknasti prsten.

6. Izračunavanje sadržaja proteina u urinu vrši se prema formuli:

C = 0,033 g / l x stupanj razrjeđenja.

194.48.155.245 © studopedia.ru nije autor objavljenih materijala. No, pruža mogućnost besplatnog korištenja. Postoji li kršenje autorskih prava? Pišite nam | Kontaktirajte nas.

Onemogući oglasni blok!
i osvježite stranicu (F5)
vrlo je potrebno

Metodički razvoj praktične nastave "Određivanje proteina u mokraći" (1 tečaj)

Centar za obuku kapitala
Moskva

Tema: Određivanje proteina urina.

Cilj: Istražiti proučavanje kemijskih svojstava urina.

Proučavanje kvantitativnih i kvalitativnih metoda za određivanje proteina urina;

Naučite osnovne principe rada s test trakama na automatskim analizatorima.

Vrsta zaposlenja: praktična (6 sati)

Učenik treba znati:

Kvalitativni uzorci za određivanje proteina.

Robertsova - Stolnikovova metoda.

Određivanje proteina 3% SSC.

Biuretska metoda određivanja proteina (THU).

Dijagnostička vrijednost istraživačkih pokazatelja.

Učenik bi trebao moći:

Pripremite radno mjesto za testiranje urina.

Pripremite reagense, posuđe i opremu za proučavanje.

Odrediti kemijska svojstva urina (proteini u urinu kvalitativnim i kvantitativnim metodama).

Rad s praznim proizvodima (izrada obrazaca za analizu).

Ispravno interpretirajte rezultate istraživanja.

Sredstva za postizanje cilja:

1. Rad s bilješkama, obrazovnom i specijalnom literaturom.

2. Priprema za praktične vježbe uz korištenje metodoloških preporuka nastavnika, provedbu i izvođenje praktičnog rada.

3. Rad s informacijskim sredstvima obrazovanja u elektroničkim i papirnim medijima.

Oprema za učionice i uredske radne stanice:

mjesta prema broju studenata;

radno mjesto nastavnika;

specijalizirani namještaj i oprema.

Alati za tehničku obuku:

računala za opremanje radnog mjesta nastavnika i učenika;

tehnički uređaji za audiovizualni prikaz informacija;

audiovizualna nastavna pomagala (prezentacija, trening video).

Rezultat ovladavanja lekcijom je:

Formiranje praktičnih vještina i početno praktično iskustvo, uključujući profesionalne (PC) i opće (QA) kompetencije:

PC 1.1. Pripremite radno mjesto za laboratorijska klinička ispitivanja.

PC 1.2. Provesti laboratorijska klinička ispitivanja bioloških materijala.

PC 1.3. Zabilježite rezultate istraživanja.

PC 1.4. Upotrijebljeni materijal zbrinite, dezinficirajte i sterilizirajte rabljenu laboratorijsku posudu, alate i zaštitnu opremu.

OK 1. Razumjeti prirodu i društveni značaj buduće profesije, pokazati postojano zanimanje za nju.

OK 2. Organizirajte vlastite aktivnosti, odaberite standardne metode i načine obavljanja profesionalnih zadataka, ocijenite njihovu učinkovitost i kvalitetu.

OK 6. Radite u timu i timu, učinkovito komunicirajte s kolegama, menadžmentom, pacijentima.

OK 9. Voditi se u uvjetima promjene tehnologije u profesionalnoj djelatnosti.

OK 13. Organizirati radno mjesto u skladu sa zahtjevima zaštite na radu, industrijske higijene, zarazne i požarne sigurnosti.

I modul. Teorijski dio s elementima samostalnog rada

Zadatak broj 1. Studij i pregledni materijal u radnim bilježnicama.

Zdrava osoba obično sadrži manje od 0,002 g / l i rijetko do 0,012 g / l proteina, a obično se taj sadržaj mokraće naziva "u obliku tragova" i ne otkriva se konvencionalnim kemijskim metodama u zdravom ljudskom urinu.

Sadržaj proteina u dijelovima urina prikupljenim u različito doba dana može značajno varirati.

Protein u urinu naziva se proteinurija.

Ovisno o dnevnom gubitku proteina razlikuju se sljedeći stupnjevi proteinurije: umjereni - do 1 g; medij - od 1 do 3 g; izražen - više od 3 g.

Postoje dvije glavne vrste proteinurije:

Proteinurija uzrokovana bolestima urinarnog trakta;

proteinurija, s lezijama (bolestima) bubrega.

Proteinurija povezana s upalnim procesima mokraćnog sustava, popraćena pojavom u urinu značajnog broja leukocita ili eritrocita, što, međutim, ne eliminira istovremeni ulazak proteina u urin iz bubrežnog parenhima; sadržaj bjelančevina rijetko prelazi 1 g / l.

Bubrežna proteinurija u većini slučajeva povezana je s povećanom propusnošću glomerula i podijeljena je u 2 skupine:

Za fiziološku proteinuriju uključeni su slučajevi privremene pojave proteina u urinu, koji nisu povezani s bolestima:

nakon konzumiranja velike količine hrane bogate nedenaturiranim proteinima (sirovo meso, sirova jaja);

s intenzivnim mišićnim radom (duge šetnje, sportski događaji);

kada se hladna kupka ili tuš;

s jakim emocionalnim iskustvima;

s epileptičkim napadajima.

Razlikovati ortostatsku, ili mladenačku, proteinuriju, koja se javlja u djece i adolescenata i koja prolazi s godinama. U diferencijalno-dijagnostičkom odnosu, praktično je važno da se ortostatska albuminurija često nalazi u razdoblju oporavka od akutnog glomerulonefritisa.

Patološka bubrežna proteinurija može biti posljedica organskih bolesti bubrega i drugih organa i sustava: akutni glomerulonefritis; kronični glomerulonefritis; akutni pijelonefritis; kronični pijelonefritis; nefropatija trudnica; razne bolesti povezane s vrućicom; teška kronična zatajenja srca; i blaga bubrežna bolest; lipoidna nefroza; tuberkuloza bubrega; hemoragijske groznice; hemoragijski vaskulitis; teška anemija; hipertenzija, itd.

Zadatak broj 2. Prepisati i nacrtati dijagrame laboratorijskih metoda za određivanje proteina u urinu.

Laboratorijske metode za određivanje proteina u urinu

Postoje kvalitativne i kvantitativne metode za određivanje proteina u mokraći, koje se temelje na koagulaciji proteina u volumenu mokraće ili na granici medija (urin i kiselina); mjerenjem stupnja koagulacije uzorak postaje kvantitativan.

uzorak s 20% sulfosalicilnom kiselinom (standardizirana);

Geller test (trenutno se ne koristi);

detekcija proteina pomoću indikatorskog papira (trake) i test traka.

jedinstvenu Brandberg-Roberts-Stolnikov metodu;

s 3% sulfosalicilnom kiselinom.

Kvalitativne metode za određivanje proteina u urinu

Zadatak broj 3. Određivanje proteina u urinu pomoću standardiziranog uzorka s 20% sulfosalicilne kiseline

Načelo metode: temelji se na koagulaciji proteina u volumenu mokraće ili na granici medija (urin i kiselina)

Posuđe, oprema i reagensi:

20% sulfosalicilne kiseline (2-hidroksi-5-sulfobenzojeva kiselina C ₇ H ₅ 0 ₆ S).

3 ml filtrirani urin

2 komada kemijske epruvete

Tri epruvete filtriranog urina unose se u dvije epruvete, 6-8 kapi sulfosalicilne kiseline dodaju se jednoj od njih (iskusni). Na tamnoj pozadini uspoređuju se obje cijevi.

Tumačenje rezultata:

Opacifikacija u epruveti ukazuje na prisutnost proteina u urinu - uzorak je pozitivan.

Napomena. Alkalni urin se zakiseli prije ispitivanja dodavanjem nekoliko kapi 10% otopine octene kiseline.

Zadatak broj 4. Određivanje proteina pomoću Geller testa

Načelo metode: Uzorak prstena temelji se na činjenici da kada se dušikova kiselina doda u urin na sučelje (kiselina - urin) u prisutnosti proteina, on se koagulira i pojavljuje se bijeli prsten.

Posuđe, oprema i reagensi:

- reagensi: 30% otopina dušične kiseline (HNO 3) (d = 1,2) ili Laryonic Reactant: 20-30 g natrijevog klorida (NaCl) otopljenog u 100 ml destilirane vode kada se zagrijava, hladi, filtrira; Doda se 1 ml koncentriranog HN03 u 99 ml filtrata.

U epruvetu uliti 1 - 2 ml 30% -tne otopine HNO 3 ili Larionovog reagensa i lagano slojeviti istu količinu filtriranog urina na zid.

Tumačenje rezultata:

Pojava na granici dvije tekućine između 2. i 3. minute tankog bijelog prstena ukazuje na prisutnost proteina u urinu.

Nacrtajte shemu za određivanje proteina

Kvantifikacija proteina

Načelo metode: Uzorak prstena Gellera temelji se na činjenici da kada se dušikova kiselina doda u urin na sučelju (kiselina - urin) u prisutnosti proteina, on se koagulira i pojavljuje se bijeli prsten.

Posuđe, oprema i reagensi:

Biološka tekućina (urin);

U epruvetu uliti 1 - 2 ml 30% -tne otopine HNO 3 ili Larionovog reagensa i lagano slojeviti istu količinu filtriranog urina na zid.

Tumačenje rezultata:

Pojava na granici dvije tekućine između 2. i 3. minute
tanki bijeli prsten ukazuje na prisutnost proteina u koncentraciji od približno 0,033 g / l. Ako se prsten pojavi prije 2 minute nakon laminacije, urin treba razrijediti destiliranom vodom i ponovno testirati s razrijeđenim urinom. Stupanj razrjeđenja urina odabire se ovisno o vrsti prstena, njegovoj širini, zbijenosti i vremenu pojavljivanja.

S prstenastim prstenom, koji se pojavio prije 2 minute, mokraća se razrjeđuje 2 puta, široka - 4 puta, s kompaktnim - 8 puta, itd. Koncentracija proteina izračunava se množenjem razrjeđenja s 0,033 g / l.

Bijeli prsten može nastati kada postoji veliki broj urata; Za razliku od proteina, pojavljuje se malo iznad granice dvije tekućine i otapa se kada se malo zagrije.

Zadatak broj 6. Određivanje količine proteina u urinu s 3% sulfosalicilnom kiselinom

Načelo metode: Koncentracija proteina u mokraći proporcionalna je zamućenosti koja nastaje kada koagulira sulfosalicilnu kiselinu

Posuđe, oprema i reagensi:

0,9% otopina natrijevog klorida;

1% otopina albumina standard - 1 g liofiliziranog albumina (iz humanog ili goveđeg seruma) otopi se u maloj količini 0,9% -tne otopine NaCl u tikvici s kapacitetom od 100 ml, a zatim nadopuni do oznake istim otapalom. Reagens se stabilizira dodavanjem 1 ml 5% otopine natrijevog azida (NaN3). Kada se čuva u hladnjaku, reagens je stabilan 2 mjeseca.

U epruvetu se stavi 1,25 ml filtriranog urina, doda se 3,75 ml 3% -tne otopine sulfosalicilne kiseline i pomiješa. Nakon 5 minuta, uzorak se fotometrira na PEC na valnoj duljini od 590–650 nm (narančasti ili crveni svjetlosni filtar) u odnosu na kontrolu u kiveti s optičkom dužinom od 5 mm. Kontrola služi kao uzorak u kojem se dodaje 3,75 ml 0,9% otopine natrijevog klorida u 1,25 ml urina. Koncentracija proteina se izračunava prema kalibracijskom grafikonu za čiju konstrukciju se pripremaju razrjeđenja standardne otopine albumina. (vidi tablicu). Iz svake dobivene razrijeđene otopine uzima se 1,25 ml i tretira se kao eksperimentalni uzorak.

Priprema razrjeđenja za kalibriranje crtanja

Standardna otopina, ml

0,9% otopina natrijevog klorida, ml

Koncentracija proteina, g / l

Pravokutna ovisnost veličine ekstinkcije i koncentracije proteina održava se do 1 g / l. Pri većim koncentracijama proteina, uzorak treba razrijediti i uzeti u obzir razrjeđenje u izračunu.

Ako u mokraći postoje tvari koje sadrže jod, mogu se dobiti lažno pozitivni rezultati. Stoga se test ne može koristiti kod pacijenata koji uzimaju jodne pripravke ili koji su podvrgnuti istraživanjima pomoću radioaktivnih spojeva koji sadrže jod. Lažno pozitivne J reakcije tijekom istraživanja mogu biti uzrokovane uzimanjem sulfanilamidnih lijekova, velikim dozama penicilina i visokim koncentracijama u urinu mokraćne kiseline.

Nacrtajte shemu za određivanje proteina

Zadatak broj 7. Otkrivanje Bens-Jonesa u mokraći

Načelo metode: temelji se na reakciji termoprecipitacije

Posuđe, oprema i reagensi:

Reagens: 2M acetatni pufer pH 4.9.

4 ml filtriranog urina pomiješa se s 1 ml otopine pufera i grije se 15 minuta u vodenoj kupelji na 56 ° C.

Tumačenje rezultata:

U prisustvu Bens-Jones proteina u mokraći, izraženi sediment pojavljuje se u prve 2 minute.

Kada je koncentracija proteina manja od 3 g / l, uzorak može biti negativan, što je vrlo rijetko, jer je obično koncentracija Bens-Jones proteina u urinu vrlo značajna.

Najpouzdanija detekcija Bens-Jones proteina je taloženje na temperaturi od 40-60 ° C. Međutim, kod previše kisele (pH manje od 3,0) ili previše alkalne (pH više od 6,5) urina, s niskom relativnom gustoćom mokraće i niskom koncentracijom Bens-Jones bež boje (manje od 3 g / l), sedimentacija se ne može pojaviti.

Nacrtajte shemu za određivanje proteina

II modul. Samostalan rad s fazom istraživanja

Zadatak broj 1. Studija i pregled primjene br. 1 "Detekcija proteina pomoću dijagnostičkih test traka"

- Dobiti uzorke biološke tekućine (urina) od učitelja, broj uzoraka;

- Provesti test urina pomoću dijagnostičkih test traka;

- Ocijenite rezultat (norma, patologija). Pretpostavimo uzrok proteina u urinu.

- Napišite rezultate u obrasce analize, predajte ih nastavniku.

"Detekcija proteina pomoću dijagnostičkih test traka"

Princip. Protein mijenja boju indikatora nanesenog na traku. Pokazatelji su pakirani u set od 100 traka, koje su pohranjene u čvrsto zatvorenoj kutiji za olovke, na hladnom i suhom mjestu.

Pravila za rad s dijagnostičkim test trakama

Kada radite s dijagnostičkim test trakama, morate poštivati ​​sljedeća pravila:

- čuvati dijagnostičke test trake u čvrsto zatvorenim spremnicima;

- skladištiti kutije na tamnom, suhom i hladnom mjestu na temperaturi do 30ºC, ali ne u hladnjaku;

- Ne izlažite trake vlazi i izravnoj sunčevoj svjetlosti, visokim temperaturama i hlapljivim kemikalijama;

- dobiti samo strogo potreban broj traka, a zatim odmah zatvoriti kućište;

- Nemojte dodirivati ​​dijagnostičke zone prstima.

Pravila testiranja

1. Za studiju, upotrijebite jutarnji urin sakupljen u plastičnu posudu za urin za jednokratnu upotrebu (ili očistite suha suđa). Izmiješajte isporučeni urin, ali ne centrifugirajte.

Kada koristite nestandardno prilagođenu ambalažu, ostaci deterdženta u spremniku za skupljanje urina uzrokuju lažne rezultate.

2. Iz kutije olovke uzmite test traku.

3. Odmah zatvorite kućište s tvorničkim poklopcem, zaštitite traku od vlage.

4. Spustite trake indikatora papira 2-3 sekunde u urin koji se ispituje i odmah ih uklonite.

5. Da bi se uklonio višak vlage iz dijagnostičkih zona trake, provesti ga s dugim rubom duž ruba spremnika (ili drugog spremnika u kojem se urin isporučuje) ili pričvrstiti taj rub trake za filtriranje papira.

Nemoguće je isprati višak mokraće iz dijagnostičkih zona.

6. Nakon isteka vremena navedenog na naljepnici spremnika ili u uputama za svaki test, isteći, usporedite boju odgovarajuće dijagnostičke zone sa skalom boja na naljepnici spremnika s prugama (standardno). Postupak ispitivanja prikazan je na slikama 1-7.

7. Reakcija se procjenjuje kao pozitivna ili negativna. Ili izražen numerički u g / l. (vidi crtež br. 8).